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操作手册

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免疫组化(IHC)

2012-10-16

操作步骤

(推荐#CK0062 免疫组化试剂盒),CK0063免疫组化笔

1、组织固定:在脱蜡之前,将切片 60°C 恒温箱中烘烤 60 分钟。

2、脱蜡:将切片用二甲苯浸泡 10 分钟,更换二甲苯后再浸泡 10 分钟。

3、水化:分别用无水乙醇浸泡 5 分钟;95%乙醇中浸泡 5 分钟;85%乙醇中浸泡5 分钟;75%乙醇中浸泡5分钟。

4、洗涤:ddH2O 浸泡 5 分钟,清洗 3 次。

5、抗原修复(煮沸法):压力锅中加入足以淹没切片的 10 mmol/L 的枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)(配制:将复性剂溶于相应体积 ddH2O 中,混匀),加热至沸腾,切片置耐热塑料切片架上,放入锅中,盖好锅盖,扣上压力阀,继续加热,设置保压 3 分钟,时间到后打开放气阀放气,压力归零后开锅盖将内锅取出放置室温冷却,待溶液冷却至室温后取出切片(约 30 分钟)。

6、洗涤:ddH2O 浸泡 5 分钟,清洗 2 次,PBST 浸泡 5 分钟,清洗 2 次。 www.sabbiotech.com 成份 20 片 50 片复性剂(溶解前请混匀) 6 g (溶于 2 L ddH2O) 15 g(溶于 5 L ddH2O)HRP 标记的二抗(抗兔/小鼠) 500 μl 1.25 ml DAB 缓冲液(20X) 50 μl 125 μl DAB 底物(20X) 50 μl 125 μl DAB 色原(20X) 50 μl 125 μl 苏木素体细胞快速染色液 1 ml 2.5 ml For Research Use Only Order:order@signalwayantibody.com Support:tech@signalwayantibody.com

7、灭活酶:每张切片滴加 50 μl 灭活酶试剂,室温避光处理 15 分钟。

8、洗涤:PBST 浸泡 5 分钟,清洗 3 次。(第一次迅速倒掉)

9、封闭:每张切片滴加 3% BSA-PBST 50 μl,湿盒中室温封闭 30 分钟。

10、加一抗:弃去封闭液,每张切片滴加 50 μl 一抗,4°C 湿盒中孵育过夜或 37°C 1 小时。

11、复温:次日取出切片,室温复温 40 分钟。(复温仅针对一抗 4°C 孵育过夜,37℃孵育直接进行下一步)

12、洗涤:PBST 浸泡 5 分钟,清洗 3 次。(第一次迅速倒掉)

13、加酶标二抗:每张切片滴加 HRP 标记的二抗(抗兔/小鼠)25 μl,室温或37°C 孵育30 分钟。

14、洗涤:PBST 浸泡 5 分钟,清洗 3 次。(第一次迅速倒掉)

15、显色(DAB 法):每张切片滴加 50 μl 显色液(显色液配制:85% ddH2O+ 5% DAB 缓冲液+5%DAB底物+5%DAB色原,避 光现配现用,按需要量配制),湿盒中显色 5 分钟。

16、终止显色:用蒸馏水终止显色反应。

17、复染:每张切片滴加 50 μl 苏木素体细胞快速染色液,染色 5 分钟,用蒸馏水冲洗干净。

18、脱色反蓝:将切片放入 1%盐酸~乙醇中脱色 3~5 秒后迅速取出放入蒸馏水中终止,再放入PBST 中反蓝5分钟。

19、封片:分别在 75%乙醇中浸泡 5 分钟;85%乙醇中浸泡 5 分钟;95%乙醇中浸泡5 分钟;无水乙醇中浸泡5分钟。用二甲苯浸泡 10 分钟,更换二甲苯后再浸泡 10 分钟。之后在切片上加中性树胶,加盖玻片。

20、观察:显微镜。

 

注意事项

 抗原修复后需冷却,避免洗涤时脱片。

 加抗体时避免交叉污染,导致假阳性。

 显色时间可根据实际染色效果来确定,不一定遵循规定的时间。

 封片时不要产生气泡,以免影响观察。

 显微镜观察时可在低倍镜下先找好视野,再换高倍镜拍照。

 如应用于冰冻切片,请用 4°C 丙酮固定 10 分钟,然后从第 6 步开始操作。

 

De-Paraffinization and Antigen Retrieval
1.    Incubate slide at 60°C for 60 min.
2.    Bath the slides in antigen retrieval solution and heat it to boil with a microwave on medium power.
       Once boiling, immediately transfer to a small power and keep faint boiling while heating for 2-3 min.
3.    Cool them to room temperature and wash rocking in distilled water several times.
4.    Immerse slides in 3% H2O2 (in fresh methanol) for 15 min at room temperature.
5.    Wash with TBS (pH 7.6) three times, 5 min each time.
 
Staining with Primary Antibody

1.    Dilute primary antibody with 3% BSA in TBS. Cover the tissue section on the slide with diluted primary
       antibody (use 50 – 150μl for each slide).
2.    Incubate at 37°Cfor 2 hours (The optimal incubation time, incubation temperature, and antibody dilution
       should be determined by the individual laboratory).
3.    Wash with TBS three times, 5 min each time.
 
Staining with Secondary Antibody

1.    Incubate with 100-200μl Polymer Enhancer. Incubate 30 min at room temperature.
2.    Wash with TBS for 3 times, 5 min each time.
3.    Incubate with 100-200μl Polymerized HRP and incubate 30 min at 37°C.
4.    Wash with TBS for 3 times, 5 min each time.
5.    Add DAB solution and incubate 3-5 min(The reaction progress and the optimal time should be determine
       according to microscope).
6.    Wash with distilled water for 2 times, 5 min each time.
7.    Counterstain sections in hematoxylin if required,wash with distilled water.Immerse slides in 0.1% HCl-
       ethanol for 1-10 seconds, wash with distilled water. Doing a counterstain of sections in hematoxylin for
       1-2 min and wash them with distilled water.
8.    Dehydrate through 100% ethanol for 5 min, 90% ethanol for 5 min, 75% ethanol for 5 min, and coverslip
       with mounting medium.

 

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