WB简介
蛋白印迹是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，将不同分子量大小的蛋白分离并转移到杂交膜上，再通过一抗／二抗复合物对蛋白质进行检测的一种免疫生化技术。
提取标本蛋白并定量
凝胶电泳分离蛋白
转移蛋白质到杂交膜
收膜和封闭
孵育一抗
洗涤
孵育酶联物（二抗或者亲和素-HRP／AP）
洗涤
底物显色或曝光检测
结果分析
1．高背景
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可能原因 |
验证或解决办法 |
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膜污染 |
使用干净镊子，戴手套操作，避免污染 |
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膜干燥 |
保证充分的反应液，避免出现干膜现象 |
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封闭不完全 封闭液不合适 |
延长封闭时间 比较尝试不同封闭液 |
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缓冲液污染 |
使用新配置的缓冲液 |
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漂洗不完全 |
增加漂洗时间和缓冲液体积 |
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抗体浓度过高 |
降低一抗、二抗浓度 |
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抗体与阻断蛋白有交叉反应 |
选择无交叉反应的封闭液，洗涤液中加入Tween-20可以减少交叉反应 |
2．信号弱或无信号
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可能原因 |
验证或解决办法 |
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抗原量不足 |
增加上样量 |
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蛋白质降解 |
重新制备样品 |
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抗原被封闭液遮挡 |
优化封闭液，缩短封闭时间，减小封闭液中的蛋白浓度 |
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样本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低 |
设置阳性对照。若靶蛋白含量低，可适当增加样本上样量 |
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膜的错误选择 |
选择合适孔径的膜。>22KD 0.45um <22KD 0.22um |
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转膜不完全
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转膜后确定转膜效率，保证胶与膜充分结合，保证电极正确装配，控制转膜温度，优化转膜电流及时间 |
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甲醇浓度过高 |
过高的甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离，从而沉淀在凝胶中。同时会使凝胶收缩或变硬，抑制高分子蛋白的转移。因此，要根据不同分子量选择合适的甲醇浓度 |
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洗膜过度 |
缩短洗涤时间或减少洗涤次数 |
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封闭过度 |
减少封闭剂的量或缩短封闭时间。更换不同封闭剂类型 |
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一抗失效 |
选择在有效期内的抗体，抗体避免反复冻融。选择现配现用的工作液 |
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一抗反应不充分 |
增加抗体浓度，延长孵育时间 |
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试剂之间不匹配 |
一抗与组织种属，一抗与二抗或和底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参可以验证二级检测系统的有效性 |
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HRP 抑制 |
所有溶液和容器中避免含有叠氮化钠 |
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酶和底物失效 |
直接将酶和底物进行混合，如果不显色说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物，使用新鲜底物 |
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曝光时间过短 |
延长曝光时间 |
3．非特异性条带
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可能原因 |
验证或解决办法 |
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蛋白上样量过大 |
降低样本上样量 |
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蛋白降解 |
使用新鲜制备的样本，并使用蛋白抑制剂 |
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细胞传代过多，导致蛋白变异 |
使用原代或传代少的细胞做对照 |
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抗体浓度过高 |
降低抗体浓度 |
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交叉反应 |
选择单克隆抗体或亲和纯化的抗体，保证抗体特异性 |
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不同异构体的存在 |
有些来源于同一基因的蛋白有不同异构体，每个异构体蛋白大小都是不同的 |
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二抗非特异性结合 |
增加二抗对照，选择其他二抗 |
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底物太灵敏 |
选择合适底物 |
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曝光时间过长 |
减少曝光时间 |
4. 条带位置不对
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可能原因 |
验证或解决办法 |
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二聚体或多聚体的存在 |
增加蛋白质变性过程及强度 |
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蛋白修饰 |
如糖基化、磷酸化等修饰状态会导致蛋白分子量增加 |
5. 条带内出现不显影圆点
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可能原因 |
验证或解决办法 |
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转膜过程有气泡 |
转膜时赶尽气泡 |
6. 条带不完整
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可能原因 |
验证或解决办法 |
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底物孵育不均匀 |
均匀孵育底物 |
7. 微笑条带
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可能原因 |
验证或解决办法 |
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电泳速度过快 |
减少电压等减慢电泳速度 |
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电泳温度过高 |
在冷室或冰浴中进行电泳 |
8. 反影（白色条带，黑色背景）
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可能原因 |
验证或解决办法 |
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HRP浓度过高 |
降低二抗浓度 |
9. 背景有黑色斑点
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可能原因 |
验证或解决办法 |
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转膜时有气泡或抗体分布不均匀 |
尽量去除气泡，抗体孵育时保持摇动 |
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封闭剂中有聚集体 |
使用前过滤封闭试剂 |
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抗体与封闭剂反应 |
选择合适的封闭剂 |
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HRP耦联二抗中有聚集体 |
过滤二抗试剂，去除聚集体 |
10.Markera变黑
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可能原因 |
验证或解决办法 |
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抗体与marker蛋白反应 |
在marker和样本之间空出一个孔不上样 |
WB实验的主要试剂
1．WB实验膜
PVDF膜，硝酸纤维素膜或尼龙膜。
2．封闭试剂
BSA或脱脂奶粉。
3．蛋白Marker
主要目的是确定靶蛋白的分子量大小；使用预染Marker还可以实时检测电泳分离情况并可以转移到膜上。
4．蛋白提取及定量
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类别 |
品名 |
SAB对应货号 |
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蛋白提取 |
总蛋白提取试剂盒 |
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核蛋白提取试剂盒 |
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膜蛋白提取试剂盒 |
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蛋白定量 |
BCA 蛋白定量试剂盒 |
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Bradford 蛋白定量试剂盒 |
5．一抗
＊选择适合检测标本种属的一抗（说明书上有验证信息）
＊选择适用于WB实验方法的一抗（说明书上有验证信息）
＊选择单克隆抗体或经过亲和纯化的多克隆抗体
＊根据说明书推荐的浓度优化最佳的抗体稀释比
6．内参
内参的作用：
1）．检测整个WB实验过程及体系是否正常工作。
2）．半定量的标准。
内参的选择：
一般为稳定表达的管家基因蛋白，来源最好选择和同时使用的一抗来源相同的，以方便二抗的选择。
内参选择：
| MW(kDa) | 全细胞 | 线粒体 | 细胞核 | 细胞膜 |
| Vinculin(124kDa） | ||||
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| HSP60(60kDa) | ||||
| α-tubulin(55kDa) | ||||
| β-tubulin(50kDa) | ||||
| β-actin(43kDa) | ||||
| GAPDH(37kDa) | TBP(38kDa) | |||
| PCNA(29kDa) | ||||
| Cofilin(20kDa) | COXIV(20kDa) | |||
7．二抗
1）．二抗的选择：
根据一抗来源种属及抗体lg亚型选择合适的二抗。
2）．二抗的使用：
根据说明书推荐的浓度稀释二抗。
孵育条件一般为室温1～2小时。
常用二抗
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二抗名称 |
SAB对应货号 |
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Goat anti-Rabbit lgG Secondary antibody HRP conjugated |
L3012 |
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Goat anti-Mouse IgG Secondary antibody HRP conjugated |
L3032 |
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Rabbit anti-Goat IgG Secondary antibody HRP conjugated |
L3042 |
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Goat anti-Rabbit lgG,FITC conjugated |
L3202 |
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Goat anti-Mouse lgG,FITC conjugated |
L3302 |
8．底物
A.显色底物：操作简便，灵敏度低，如TMB、DAB、BCIP／NBT。
B.化学发光底物：灵敏度高，需要曝光检测设备（暗室、曝光设备和胶片）或者凝胶成像设备。
9．各种溶液
A．封闭液：一般为含有1～5％BSA或者5％脱脂奶粉的PBS／PBST（0.1M，Ph7.4）或TBS／TBST；也可以购买商业化的试剂。
B.稀释液：一般为封闭液或者单独的PBST／TBST，也可以购买商业化的试剂。
C.洗涤液：一般为PBST／TBST，也可以购买商业化的试剂。
