针对不同样本类型的处理注意事项
一、细胞样本
贴壁细胞：弃去培养基，用PBS清洗2-3次。
悬浮细胞：将细胞悬液4℃离心，弃上清，收集细胞沉淀，向细胞沉淀中加入预冷的PBS，轻轻重悬细胞，再次离心，弃上清。重复2-3次以洗净培养基。收集细胞后，根据目标蛋白定位，选择合适的裂解液并提前添加蛋白酶抑制剂，防止蛋白降解。
➤ 总蛋白提取可选RIPA裂解液或使用试剂盒（#PE001）https://www.sabbiotech.cn/products/PE001
➤ 核蛋白提取推荐使用专门试剂盒（#PE002）https://www.sabbiotech.cn/products/PE002
➤ 膜蛋白需选用含强去垢剂(如SDS)的裂解液或试剂盒（#PE003）https://www.sabbiotech.cn/products/PE003
加入预冷裂解液，用移液器反复吹打，使裂解液与细胞充分混匀，在冰上裂解15-30min，贴壁细胞在裂解期间用刮刀把细胞刮下，反复吹打几次，悬浮细胞在裂解期间数次震荡，以助裂解充分，裂解后 4℃12000 rpm ，10-15min离心取上清。全程冰上操作，处理好的样本分装后低温保存，避免反复冻融。
二、组织样本
PBS冲洗组织去除多余的血液，称量组织并剪碎。加入一定比例预冷的裂解液和蛋白酶抑制剂，手工或使用匀浆器 / 破碎仪等将样本匀浆充分，可配合超声处理，提高蛋白得率，4℃12000rpm，15-20min离心收集上清并分装低温保存，避免反复冻融。
三、血清/血浆样本
血清处理：将血清在室温下凝固(不超过2h)，4℃离心取上清并分装低温保存，避免反复冻融。
血浆处理：采血装入抗凝管，立即颠倒混匀，4℃离心取上清并分装低温保存，避免反复冻融。
样本处理小贴士
1. 处理样本时务必添加蛋白酶抑制剂，以防蛋白降解，若检测目标蛋白磷酸化状态，除蛋白酶抑制剂外还需添加磷酸酶抑制剂，以防目标蛋白去磷酸化。
2. 富含脂肪 / 油脂的样本去除油脂层后再取样；产生沉淀的样本，吸取上清，避免吸到沉淀造成WB拖带。
3. 膜蛋白本身蛋白丰度不高，提取后，可结合超声处理。取样加Loading buffer后不用煮沸，采用 50℃保温30分钟。Loading buffer中SDS终浓度含量可以提高至 3%-10%。若有些样品的膜蛋白含量太低，可以使用丙酮沉淀膜蛋白，再使膜蛋白溶解于上样缓冲液中，电泳时采用低电压低电流。
4. 粘稠或难溶样本（如核蛋白，富含核酸蛋白）。用强裂解液或可通过超声打断DNA，用注射器反复抽吸，适当延长煮沸时间等方式处理。
5. 血清 / 血浆样本中白蛋白与球蛋白占比较大，目的蛋白通常含量极低，不推荐选用这类样本做WB，也可将样本进行浓缩或去白蛋白和球蛋白处理。
针对不同分子量的蛋白跑胶及转膜条件
小分子蛋白（＜30 kDa）
电泳：分离胶浓度15％或梯度胶，低压慢跑，观察marker位置，及时终止。
转膜：用0.22μm膜，恒流150-200mA，湿转30-60min。
中分子蛋白（30–100 kDa）
电泳：分离胶浓度10%-12%或梯度胶，正常电泳即可。
转膜：0.45μm膜，恒流200mA，湿转60-90min。
较大分子蛋白（100-200 kDa）
电泳：分离胶浓度8%或梯度胶，正常电泳即可。
转膜：0.45μm膜，恒流200mA，湿转1.5h-2h。
大分子蛋白（>200 kDa）
电泳：分离胶浓度6%或梯度胶，低压慢跑，注意温度。
转膜：0.45μm膜，恒流200mA，4℃过夜。
特殊分子量蛋白小贴士
1. 小分子蛋白转膜缓冲液中去除SDS；甲醇浓度20%-30%。
2. 大分子蛋白缓冲液里加入0.02%-0.1%的SDS；甲醇浓度<10%。
